Implemente rapidamente projetos de citômetros de fluxo usando módulos de aquisição de dados de alta precisão

A citometria de fluxo é amplamente utilizada por clínicos e diagnosticadores para analisar as características celulares. Uma célula de cada vez, eles avaliam opticamente os níveis de proteína, a saúde do sangue, a granularidade e o tamanho da célula, entre outros atributos. Embora sejam sistemas altamente sensíveis, os projetistas de citômetros estão sob pressão constante para acelerar o tempo de análise, exigindo novas abordagens tanto para a citometria de fluxo quanto para sua eletrônica associada.

Os citômetros sujeitam as células individuais à luz laser para criar sinais dispersos e fluorescentes. Para capturar, de forma rápida e precisa, a luz resultante e convertê-la em sinais digitais é necessário um fotodiodo de avalanche (APD) e eletrônica complexa. Os circuitos para este processo podem levar muito tempo para ser projetados e implementados, particularmente dado que os sistemas de aquisição de dados de citometria de fluxo requerem dispositivos de alta velocidade e baixo nível de ruído para garantir a precisão do sistema.

Para suportar de forma econômica a análise de citometria de fluxo mais rápida, os projetistas podem resolver problemas de velocidade e precisão com uma solução de aquisição de dados que inclui controladores amplificadores internos e um conversor analógico-digital (ADC).

Este artigo mostrará brevemente como funcionam os sistemas de citometria de fluxo. Em seguida, apresenta o ADAQ23878 da Analog Devices, um módulo ADC de 18 bits, e mostra como ele pode ser usado para projetar um estágio de detecção e conversão de um citômetro de fluxo. Um kit de avaliação associado também será introduzido.

Princípios de citometria de fluxo moderna

A citometria de fluxo moderna é um processo automatizado que analisa moléculas celulares e de superfície, caracteriza e define diferentes tipos de células em uma população celular heterogênea. Sem contar o tempo de preparação, que pode ser superior a uma hora, o instrumento realiza uma avaliação de três a seis características de 10.000 células isoladas em menos de um minuto.

Para permitir isto, a etapa de preparação de células isoladas da citometria de fluxo é crítica. A organização das amostras ocorre, de forma hidrodinâmica, em um fluido de revestimento para focalizar células ou partículas em um escoamento de amostras enfileiradas de células isoladas para análise. Com esta transformação, as células isoladas devem manter suas características biológicas naturais e seus componentes bioquímicos.

A Figura 1 mostra um diagrama de um instrumento de citômetro de fluxo que começa na parte superior com a amostra de várias células.

Figura 1: Diagrama de um citômetro de fluxo, desde a focalização do revestimento até a aquisição de dados. (Fonte da imagem: Wikipedia, modificado por Bonnie Baker)

Os seis componentes principais do citômetro de fluxo são uma célula de fluxo, um laser, um fotodiodo de avalanche (APD), um amplificador de transimpedância (TIA), um ADC e um computador para coleta e análise de dados.

O citômetro de fluxo tem um escoamento líquido ou fluido de revestimento, que é estreitado para transportar e alinhar as células em uma única fila através do feixe de luz. A luz laser capta uma célula de cada vez, criando um sinal de luz de dispersão frontal (FSC) e um sinal de luz de dispersão lateral (SSC). A luz de fluorescência é selecionada usando espelhos e filtros e depois amplificada por um APD.

O próximo passo é detectar, digitalizar e analisar a saída de luz resultante após atingir o APD. Para detecção, o amp-op de entrada FET, baixo ruído de tensão, corrente de polarização ultrabaixa e 500 megahertz (MHz) LTC6268 da Analog Devices é ideal para o TIA de alta velocidade necessário para a detecção.

Figura 2: O circuito TIA usa um APD (PD₁) e um amp-op FET de baixa corrente de entrada para converter correntes ultrabaixas do fotodiodo para uma tensão de saída em IN1+. (Fonte da imagem: Bonnie Baker)

É essencial projetar este circuito amplificador com a maior largura de banda possível, assim as capacitâncias parasitas devem ser minimizadas. Por exemplo, a capacidade parasita da realimentação, C, influencia a estabilidade do circuito e a largura de banda na Figura 2. Independentemente da escolha do invólucro de resistor, sempre haverá uma capacitância parasita no caminho de realimentação do amplificador. Entretanto, um invólucro 0805, que tem uma distância maior entre as extremidades e a menor capacitância parasita, é preferível para aplicações de alta velocidade.

Aumentar a distância entre as extremidades do R₁ não é a única maneira de diminuir a capacitância. Outra maneira de reduzir a capacitância de placa a placa é proteger os caminhos do campo E que dá origem à capacitância parasita, colocando uma trilha extra de terra sob a resistência, R₁ (Figura 3).

Figura 3: A adição de uma trilha de terra sob o resistor de realimentação afasta o campo E do lado da realimentação e o joga para o terra. (Fonte da imagem: Analog Devices)

Neste caso, o método envolve especificamente a colocação de uma pequena trilha de terra abaixo e entre as ilhas do resistor perto da extremidade de saída do TIA. Esta técnica torna um valor de capacitância parasita de 0,028 picofarads (pF) com uma largura de banda do TIA de 1(2π*R_F*C_PARASITIC), igual a 11,4 MHz.

Os sinais luminosos ópticos apontam para vários diodos de avalanche com filtros ópticos apropriados. O APD, TIA e sistema ADC converte esses sinais para sua representação digital e envia os dados para o microprocessador para análise posterior.

Os instrumentos modernos geralmente têm vários lasers e APDs. Os dispositivos comerciais atuais possuem dez lasers e trinta fotodiodos de avalanche. Aumentar o número de detectores a laser e fotomultiplicadores permite a rotulação de vários anticorpos para identificar de forma precisa as populações-alvo através de marcadores fenotípicos.

Ainda assim, a velocidade da análise depende de um bom equilíbrio entre:

• A velocidade do revestimento do fluido
• A capacidade do processo de foco hidrodinâmico de formar linhas de células isoladas
• O diâmetro do túnel
• A capacidade de preservar a integridade da célula
• A eletrônica

Focalização acústica da citometria de fluxo

Enquanto a adição de vários lasers e APDs acelera a análise e identificação, na melhor das hipóteses, os mais recentes métodos modernos de citometria de fluxo de células isoladas podem coletar dados sobre até um milhão de células individuais por minuto. Em muitas aplicações, tais como a detecção de células tumorais circulantes presentes no sangue em níveis tão baixos quanto 100 células por mililitro, isto é inadequado. Em aplicações clínicas de células raras, os testes exigem regularmente a análise demorada de bilhões de células.

A alternativa ao processo de preparação da célula com foco hidrodinâmico é um processo de focalização acústica. Aqui, um material piezoelétrico, como o titanato zirconato de chumbo (PZT), é fixado a um capilar de vidro para converter pulsos elétricos em vibrações mecânicas (Figura 4a). Ao utilizar um PZT para vibrar as paredes laterais de um capilar de vidro retangular na frequência ressonante da célula de fluxo, o sistema gera uma variedade de ondas estacionárias acústicas com números variáveis de nós de pressão.

Figura 4: Uma ilustração de uma célula de fluxo acústico feita com um capilar de vidro retangular (a). A localização dos três primeiros nós de pressão para um capilar de largura fixa (b). (Fonte da imagem: National Center for Biotechnology Information)

Estes nós de frequência do PZT alinham as partículas que fluem em múltiplas e discretas linhas de escoamento (Figura 4b). A célula de fluxo acústico usa uma onda estacionária acústica linear, para sintonizar em vários comprimentos de onda, criando harmônicas simples ou múltiplas. Como previsto pelo modelo simples de onda estacionária linear, as células na amostra produzem linhas únicas ou numerosas de células isoladas dentro da câmara de fluxo.

Com esta organização precisa das células, a largura do túnel de revestimento de fluxo pode se ampliar para permitir taxas de fluxo mais rápidas para além do feixe laser (Figura 5).

Figura 5: Com o escoamento hidrodinâmico de amostras (c. e d.), conforme a largura do revestimento aumenta, as amostras de células se dispersam, dificultando o processo de medição ótica. Escoamentos de amostras com focalização acústica (a. e b.) mantém as células em fila única, independentemente da largura do revestimento. (Fonte da imagem: Thermo Fischer Scientific)

A focalização hidrodinâmica tradicional (Figura 5c.) organiza as linhas de células isoladas em preparação para a varredura a laser. Enquanto um funil mais largo para o núcleo de escoamento da amostra permite uma maior velocidade do material de revestimento (Figura 5d.), também resulta no espalhamento de células isoladas, produzindo variação de sinal e comprometendo a qualidade dos dados.

A focalização acústica (Figura 5a.) posiciona as células biológicas e outras partículas em alinhamento estreito, mesmo com um túnel mais largo. Este alinhamento preciso das células permite taxas de amostragem mais altas enquanto mantém a qualidade dos dados (Figura 5b.).

Na prática, a focalização acústica da citometria de fluxo aumenta a frequência de amostragem celular em cerca de 20x (Figura 6).

Figura 6: Comparação do tempo de amostragem para vários equipamentos de citometria de fluxo com base na citometria de fluxo de fluido (A, B, C) versus a citometria de focalização acústica (D). (Fonte da imagem: Thermo Fischer Scientific)

Na Figura 6, os equipamentos A, B e C utilizam tecnologia hidrodinâmica, enquanto D utiliza a abordagem do fluxo de citometria de focalização acústica.

Aquisição de dados de citometria de fluxo com focalização acústica

O projeto da eletrônica para equipamento de citometria de fluxo com focalização acústica requer eletrônicos fotossensíveis de alta velocidade para acomodar a velocidade das células sanguíneas e do fluido de revestimento através do bocal de maior diâmetro. O LTC6268 de alta velocidade de 600 MHz mencionado anteriormente, em combinação com um layout especial do invólucro 0805 do resistor, eleva a taxa de detecção óptica para 11,4 MHz (Figura 7, à esquerda). A saída do LTC6268 é alimentada por um ADC ADAQ23878 da Analog Devices para digitalização.

Figura 7: O ADC ADAQ23878 digitaliza o sinal óptico do fotodiodo (PD₁) e o circuito TIA (esquerda). (Fonte da imagem: Bonnie Baker)

O ADAQ23878 é uma solução de aquisição de dados de 18 bits, 15 mega amostras por segundo (MSPS), de precisão num invólucro SIP (system-in-package). Ele reduz bastante o ciclo de desenvolvimento dos sistemas de medição de precisão ao transferir a carga de projeto de seleção, otimização e layout dos componentes do controlador de entrada do projetista ao dispositivo.

A abordagem modular do SIP reduz a contagem final de componentes do sistema ao combinar múltiplos blocos de processamento e condicionamento de sinais comuns em um único dispositivo, juntamente com o ADC registrador de aproximação sucessiva (SAR) de alta velocidade, 18 bits e 15 MSPS. Estes blocos incluem um amplificador controlador de baixo ruído do ADC, totalmente diferencial e um buffer de referência estável.

O ADAQ23878 também incorpora os componentes passivos críticos que utilizam a tecnologia iPassive da Analog Devices para minimizar fontes de erro dependentes da temperatura e otimizar o desempenho. O estágio controlador de assentamento rápido do ADC contribui para sua capacidade de garantir a rápida aquisição de dados.

Avaliando o µMódulo ADAQ23878

Para avaliar o ADAQ23878, a Analog Devices fornece a placa de avaliação EVAL-ADAQ23878FMCZ (Figura 8). A placa demonstra o desempenho do μMódulo ADAQ23878 e é uma ferramenta versátil para avaliar um projeto front-end de citometria de fluxo, além de uma variedade de outras aplicações.

Figura 8: A placa de avaliação EVAL-ADAQ23878FMCZ para o ADAQ23878 possui circuitos de potência incorporados, vem com software associado para controle e análise de dados, e é compatível com SDP-H1. (Fonte da imagem: Analog Devices)

A placa de avaliação EVAL-ADAQ23878FMCZ requer um computador pessoal rodando Windows 10 ou superior, uma fonte de sinal de precisão e baixo ruído, e um filtro passa-faixa adequado para testes de 18 bits. A placa de avaliação precisa do plug-in ACE ADAQ23878 e do controlador SPD-H1.

Conclusão

O exame de uma célula biológica de cada vez, utilizando técnicas padrões de citometria de fluxo de foco hidrodinâmico tem sido bem sucedido, mas com a necessidade de análises mais rápidas, houve uma mudança para técnicas baseadas em métodos de fluxo de foco acústico. Entretanto, a eletrônica que suporta citometria de fluxo mais avançada também deve melhorar, enquanto minimiza espaço, custo e tempo de desenvolvimento.

Como mostrado, o amp-op de alta velocidade LTC6268 e a solução de aquisição de dados μMódulo ADAQ233878 de alta velocidade e precisão podem ser combinados para criar o sistema completo de aquisição de dados para equipamentos avançados de citometria de fluxo.